Хімія

Підготовка до стажування з генної інженерії


Виробництво компетентних клітин: хлорид кальцію та кальцій фосфатний метод

У природних умовах багато бактерій здатні поглинати генетичний матеріал із свого середовища, хоча і з малою ефективністю. У молекулярній біології розроблено різні методи, які на короткий час підвищують проникність клітинних мембран і таким чином підвищують ефективність поглинання ДНК. Для грамнегативних клітин, як кишкова паличка це насамперед такі методи, як електропорація та виробництво так званих компетентних клітин. Термін «компетентність» у цьому контексті означає здатність клітин поглинати ДНК, тобто бути здатними трансформуватися.

Метод хлориду кальцію

Для бактерій кишкова паличка У більшості випадків для створення компетентних клітин використовується метод хлориду кальцію. У цьому процесі клітини-господарі обробляють 0,1 молярним розчином хлориду кальцію. Надлишок іонів кальцію змінює проникність мембрани і підвищує здатність клітин поглинати чужорідну ДНК, але механізм цього явища досі не з’ясований.

Компетентні клітини можна виробляти у великих масштабах і при -70 ° С може зберігатися протягом трьох-чотирьох місяців без втрати компетенції. Під час пізнішої трансформації оптимальне поглинання ДНК досягається, якщо компетентні клітини піддаються холодно-тепловій обробці (тепловий шок, наприклад, 3 хв на 42 ° С або 10 хв на 37 ° С). Якщо рекомбінантна ДНК несе ген резистентності як маркер, трансформовані клітини спочатку переносять у просте живильне середовище (наприклад, середовище LB), щоб забезпечити експресію гена стійкості, перш ніж культуру можна буде перенести на селективне середовище.

За допомогою цієї техніки до 105-109Первинні трансформанти утворюються на мкг ДНК.

Кальцій-фосфатний метод

При трансфекції використовується кальційфосфатний метод.

У цій техніці ДНК змішується з хлоридом кальцію та буферним розчином, що містить фосфат. Це призводить до утворення дрібних кристалів фосфату кальцію ДНК, які при контакті з клітинами осідають на поверхні клітини. Поглинання ДНК клітиною потім опосередковується за допомогою ендоцитозу. Цей механізм також багато в чому незрозумілий.


Відео: Як я склала ЗНО на 195+ балів? Книги,корисні ресурси та власні поради (Січень 2022).